Plateforme pour l’eau, le gaz et la chaleur
28. mai 2019

Cytométrie de flux

Analyse de la qualité microbiologique de l'eau potable dans le réseau

La cytométrie de flux quantifie le nombre de cellules ou de bactéries totales (TCC), intactes (ICC), les grandes (HNA) et les petites (LNA) cellules dans une eau et donne rapidement après prélèvement une image de la qualité bactériologique de l’eau d’un réseau. Une surveillance en temps réel d’un réseau est devenue une réalité avec l’analyse par cytométrie de flux en continu. Cet article montre les avantages de cette technique pour le suivi microbiologique d’un réseau de distribution.
Paul-Etienne Montandon, Marta Cassaro Hainard, Maureen Guns, Jean-Félix Marguet, Nicolas Eichenberger, 

détermination de la teneur en bactéries d’une eau

Une contamination d’un réseau d’eau peut se produire le long de la chaîne de production, de transport et de distribution [1–4]. Elle peut passer inaperçue, mais, en cas d’intrusion d’un agent pathogène, une maladie d’origine hydrique peut se déclencher chez les consommateurs [1, 5–7]. L’analyse bactériologique d’échantillons d’eau par mise en culture dans des milieux spécifiques donne des résultats un à trois jours après le prélèvement [8], c’est-à-dire une fois que l’eau a été distribuée et, probablement, consommée. Si cette méthode convient parfaitement pour vérifier les valeurs maximales établies par la législation, elle ne permet pas d’intervenir rapidement en cas de contamination.
L’analyse en continu de paramètres physico-chimiques, tels que le pH, la conductivité, la température, l’absorbance UV, la turbidité et le potentiel rédox donne des informations qui rendent possible la détection des anomalies les plus courantes, notamment des problèmes de type microbiologique [9–11]. La transmission de ces données à un centre de contrôle offre une image en temps réel de la qualité de l’eau du réseau et permet d’intervenir rapidement en cas de variation significative de la valeur d’un ou de plusieurs paramètres [12]. Une telle surveillance s’apparente à un système d’alarme précoce [13] qui a pour objectif d’identifier un incident de faible probabilité, mais d’impact important, tout en donnant le temps d’en diminuer les conséquences par une intervention rapide.
L’application de la cytométrie de flux pour la détermination de la teneur en bactéries d’une eau a considérablement raccourci le temps d’analyse [14]. La cytométrie de flux mesure le nombre de bactéries ou de cellules totales (TCC), intactes (ICC), la part des grandes (HNA: high nucleic acid) et des petites cellules (LNA: low nucleic acid) dans une eau en une vingtaine de minutes [15, 16]. Le dénombrement de micro-organismes spécifiques est également réalisable, à l’exemple de la bactérie Legionella pneumophila SG 1, après concentration, purification et marquage avec un anticorps fluorescent [17, 18]. L’automatisation de l’analyse d’eau fournit une image en temps réel de sa teneur en cellules [19–21]. Un appareil de mesure en continu des cellules totales a été mis sur le marché récemment [22].
Cet article, qui présente le suivi des cellules totales et intactes dans les réseaux des villes de La Chaux-de-Fonds et du Locle, montre que la mesure des cellules représente un bon paramètre pour le contrôle de la qualité bactériologique de l’eau de réseau. 

LA CHAUX-DE-FONDS

L’eau brute et filière de potabilisation

La ville est approvisionnée par l’eau des sources et des captages situés dans les gorges de l’Areuse [23]. L’eau brute est traitée par chloration à l’usine des Moyats puis acheminée aux réservoirs du Vuillème et des Foulets à La Chaux-de-Fonds par pompage et écoulement gravitaire. L’eau est à nouveau chlorée à l’entrée des deux réservoirs pour limiter la croissance bactérienne dans le réseau. La ville est aussi alimentée à 8,5% environ par de l’eau du réseau du SIVAMO, un réseau d’eau chlorée qui assure une alimentation en eau de secours et d’appoint [24, 25]. Le SIVAMO transporte de l’eau traitée provenant des sources de la ville de Neuchâtel situées dans les gorges de l’Areuse et du lac de Neuchâtel. L’eau des sources est traitée par chloration au chlore électrolytique et celle du lac est purifiée par une pré-chloration au dioxyde de chlore, une préfiltration sur filtres à double couche de pierre ponce et de sable de quartz, une filtration à travers des filtres à charbon actif et une désinfection finale au chlore gazeux (voir aussi encadré).
Ces eaux traitées, en particulier celle du lac, ne sont pas très stables sur le plan biologique [26]. En période normale, le SIVAMO est approvisionné essentiellement avec de l’eau des sources, alors qu’en étiage de l’eau du lac est ajoutée, dont la part peut devenir importante en cas de sécheresse prolongée. Cette eau est introduite dans le réseau de la ville par le réservoir des Foulets.

Réseau de distribution

Le réseau de la ville comprend trois zones de pression (ZP; fig. 1): la ZP ville (zone rapprochée), la ZP Pouillerel (zone intermédiaire) et la ZP Mt Cornu (zone éloignée). Après passage dans les réservoirs des Foulets et du Vuillème, l’eau traitée est déversée dans la ZP ville. La ZP Mt Cornu est approvisionnée par pompage de l’eau de la ZP ville dans le réservoir du Mt Cornu. L’eau est à nouveau chlorée à la sortie du réservoir du Mt Cornu. Le réservoir du Vuillème alimente par une conduite de transport le réservoir de Plaisance d’où l’eau est pompée au réservoir de Pouillerel. L’eau est chlorée pendant le pompage. La circulation de l’eau dans la ZP Mt Cornu est particulièrement lente et l’eau peut séjourner 10 à 15 jours avant d’atteindre les extrémités de réseau au Bas-des-Brandt, aux Escaliers, à la Haute-Fie, au Seignat et aux Planchettes.

Développement des germes aérobies mésophiles en fin de réseau

Dès 2010, Viteos a abaissé la teneur en chlore résiduel dans les réseaux exploités. Cet objectif a été atteint en diminuant la quantité de chlore introduite pour le traitement de l’eau brute et en mettant en place des chlorations secondaires, notamment en amont des secteurs dans lesquels la circulation de l’eau est particulièrement lente. L’augmentation de la fréquence des analyses microbiologiques en fin de réseau complète la surveillance. Ces contrôles révèlent parfois l’apparition de coliformes et un développement des germes aérobies mésophiles (GAM) aux extrémités du réseau, en particulier lorsque la température de l’eau augmente (fig. 2). Des purges ponctuelles du réseau local sont effectuées en cas de dépassement des exigences microbiologiques. Des analyses subséquentes démontrent leur efficacité.

Teneurs en TCC et en ICC dans les zones de pression du réseau

Les analyses par cytométrie de flux des échantillons prélevés aux extrémités du réseau confirment ce constat (fig. 3a à 3d). Le nombre de cellules totales augmente en fonction de l’éloignement du réservoir des Foulets alors que la teneur en HNA s’élève sensiblement dès la sortie du réservoir. Le nombre de cellules intactes, qui est bas à l’arrivée du réservoir des Foulets, augmente dans le réseau en fonction du temps de séjour de l’eau. Le taux d’HNA, peu élevé lors du transport de l’eau des Moyats à La Chaux-de-Fonds (< 30%), dépasse déjà 60% à la sortie du réservoir, démontrant que le réseau offre des conditions favorables au développement des cellules.
Le suivi analytique aux points de prélèvements des ZP ville, Pouillerel et Mt Cornu présente des pics de cellules (août à novembre 2016, janvier à février 2017 et août à septembre 2017) qui correspondent à des périodes d’étiage
(fig. 4a à 4c):

ZP ville

Dans la ZP ville, les teneurs en TCC et ICC sont basses et assez stables de janvier à août 2016 puis les TCC augmentent de manière significative, alors que le développement des ICC reste plus modéré (fig. 4a).

ZP Pouillerel

Les valeurs des TCC et des ICC dans la ZP Pouillerel sont tout d’abord basses, assez stables à variables, puis elles croissent modérément, voire de manière signifi­cative, dès la fin du mois d’août 2016 (fig. 4b).

ZP Mt Cornu

On constate des valeurs variables et assez élevées des cellules dans la ZP Mt Cornu puis une augmentation assez nette à la fin du mois d’août (fig. 4c).

Comparaison par point de prélèvement

La comparaison de la teneur moyenne des cellules par point de prélèvement en période normale montre des valeurs basses et assez stables dans les ZP ville et Pouillerel avec un développement significatif dans la ZP Mt Cornu (fig. 5). En étiage, on constate une hausse des TCC dans les ZP ville et Pouillerel et une augmentation significative des TCC et des ICC dans la ZP Mt Cornu. La présence de chlore résiduel dans les ZP ville et Pouillerel restreint le développement bactérien en condition normale et également, dans une certaine mesure, en étiage. En fait, le chlore présente une dualité d’action dans un réseau d’eau. Il inactive les cellules intactes en endommageant leur membrane [27]; les cellules non viables se rangent ensuite parmi les cellules totales. Le chlore produit aussi du carbone organique assimilable (COA) par oxydation du carbone organique de l’eau [28]. Le COA possède le potentiel de favoriser la recrudescence des bactéries dans un réseau, lorsque la teneur en oxydant devient négligeable [29]. Dans la ZP Mt Cornu, le temps de résidence de l’eau dans les conduites, l’introduction de chlore pour la protection du réseau, la très faible teneur en résidu d’oxydant aux extrémités du réseau et le COA sont des facteurs déterminants pour la multiplication bactérienne.

Rapport nombre de cellules en étiage/nombre de cellules en condition normale

L’analyse du rapport entre les teneurs moyennes des cellules en étiage et de celles en condition normale par point de prélèvement révèle des valeurs proches de 1 pendant le transport de l’eau traitée (départ Moyats et arrivée Foulets) puis entre 2 et 9 dans le réseau (fig. 6). Cette constatation montre l’influence de l’eau du SIVAMO. En effet, en étiage, l’apport d’eau du SIVAMO devient plus important qu’en temps normal. Cet appoint a représenté 17% de l’eau alimentant la ville de La Chaux-de-Fonds d’août à novembre 2016. L’eau approvisionnant le SIVAMO contenait pendant cette période en moyenne 43% d’eau traitée du lac de Neuchâtel, dont les teneurs en COA ainsi qu’en TCC et ICC (fig. 7) sont plus élevées que celles de l’eau chlorée des sources. L’utilisation accrue de l’eau du SIVAMO en étiage représente donc un apport supplémentaire en cellules, en carbone organique et en COA dans le réseau de La Chaux-de-Fonds. Le résultat de cet appoint est un développement bactérien plus important en étiage qu’en condition normale, en particulier aux extrémités du réseau.
Finalement, les facteurs susceptibles de favoriser la multiplication des germes dans un réseau sont un apport secondaire d’eau, le temps de séjour et la température de l’eau dans les conduites ainsi que la disparition du résidu de
désinfectant [30].

LA VILLE DU LOCLE

L’eau brute, filière de potabilisation et réseau de distribution

Les eaux des sources et des captages situés à l’ouest, au centre et à l’est de la ville sont acheminées par trois canalisations au réservoir d’eaux brutes, qui se trouve au centre de la ville, puis pompées et traitées à la chaîne de traitement (CTE), distante de quelques dizaines de mètres du réservoir. Le traitement de l’eau brute a lieu chaque nuit [7]. La chaîne de traitement comprend une oxydation avancée, une floculation-coagulation au polychlorosulfate d’aluminium, une filtration sur un filtre bicouche (hydro-anthracite et sable de quartz), une filtration ascendante (LUCA) puis descendante sur charbon actif (CA) et une désinfection avec du chlore électrolytique. Les eaux traitées sont pompées dans les réservoirs du Communal et du Voisinage, qui alimentent la ZP inférieure, respectivement, la ZP supérieure.
La ville est également approvisionnée à environ 8% avec de l’eau du SIVAMO qui est distribuée dans la ZP des Monts sur les hauteurs et au nord de la ville. Occasionnellement, de l’eau peut également passer dans les ZP inférieure et supérieure du réseau.

Installation pilote: Détection d’une contamination microbiologique

Afin d’analyser si la mesure des cellules en continu permet de détecter une pollution microbiologique d’un réseau, des essais de contamination d’une eau par des eaux usées et épurées ont été effectués dans une installation pilote (fig. 8). Des eaux usées et épurées provenant de la station communale de traitement des eaux usées (STEP) de la ville du Locle ont été ajoutées à de l’eau prélevée à la chaîne de traitement après le filtre à charbon actif (eau filtrée) et le mélange a été analysé avec un appareil de mesure de cytométrie de flux en continu [22].
L’ajout d’eaux épurées à de l’eau filtrée à une concentration finale de 5% provoque une augmentation rapide du nombre de cellules totales (fig. 9a), suivie d’une baisse après quelques heures et, enfin, d’une élévation importante de la population à la fin de l’essai. La part des HNA passe d’environ 50% (eau filtrée) à 75% après l’adjonction des eaux épurées. Les diagrammes de dispersion des cellules confirment la prédominance des HNA dès l’ajout des eaux épurées (fig. 9b-x et 9b-y).
Les empreintes de la flore bactérienne [31] de l’eau filtrée (fig. 9b-x), de l’eau après contamination (fig. 9b-y) et de l’eau à la fin de l’essai (fig. 9b-z) sont bien différentes et indiquent une modification de la population bactérienne au cours de l’expérience. Ces résultats suggèrent que les bactéries, qui se sont développées dans la STEP et qui ont participé à l’épuration biologique, ont péri après dilution de l’échantillon dans de l’eau filtrée car elles ne disposaient plus des conditions favorables à leur développement [32, 33]. D’autres bactéries moins exigeantes sur le plan nutritif se sont ensuite multipliées au dépend du COA qui résulte de la dégradation des cellules mortes, auquel s’ajoute celui provenant des eaux usées traitées.

Analyse de l’eau du réseau: augmentation subite et temporaire des TCC

Le suivi en continu des TCC et des HNA a aussi été effectué dans l’eau brute, dans l’eau en traitement et dans l’eau du réseau du Locle.
Les analyses de l’eau brute et de l’eau en traitement ont été présentées dans un article précédent [21]. En résumé, les résultats ont montré un abattement important du nombre de cellules dans l’eau brute pendant l’étape d’oxydation, puis une augmentation dans les filtres bicouche et LUCA pour atteindre un peu moins de 70'000 TCC/ml dans le réservoir d’eau traitée. La part des HNA, qui représente environ une petite moitié des cellules dans l’eau brute, s’abaisse dans les chambres d’oxydation 2 et 3, augmente à la sortie de l’oxydation avancée à environ 70% pour se stabiliser à 40% dans le bassin d’eau traitée.
La surveillance en continu de la qualité microbiologique de l’eau du réseau a ensuite été abordée. L’eau de la ZP inférieure, qui a été prélevée à la chaîne de traitement après passage dans le réseau de distribution, a été analysée par cytométrie de flux en continu du 17 au 21 novembre 2016 (étiage). L’analyse a révélé une arrivée importante et passagère d’une eau contenant des TCC et principalement des LNA le 17 novembre (fig. 10). Les recherches effectuées ont démontré que cette eau provenait du SIVAMO, car les analyses du pH et de la conductivité, mesurées en continu à cet endroit, ont donné des valeurs proches de celles déterminées dans l’eau du lac de Neuchâtel. Plusieurs autres pics de moindre importance comprenant surtout des LNA se sont ensuite succédés au cours des jours suivants, confirmant ainsi que l’eau du SIVAMO passe occasionnellement de la ZP des Monts dans la ZP inférieure.

Transmission des données au centre de gestion

Les données de cytométrie de flux en continu mesurées dans le bassin d’eau traitée sont transférées au centre de gestion via un superviseur. Les valeurs des TCC, des HNA et du chlore sont suivies en temps réel (fig. 11). Les teneurs en chlore passent de 0,12 mg/l au démarrage de la chaîne de traitement à 0,1 mg/l pendant quelques heures pour s’abaisser progressivement dès l’arrêt des installations jusqu’à 0,02 mg/l.
Les TCC, dont le nombre de cellules varie entre 45'000 et 60'000 par ml, présentent des pics passagers (environ 110'000 cellules/ml) qui coïncident avec les maxima de chlore. Les HNA fluctuent entre 50 et 58% des cellules totales, mais diminuent de manière importante et momentanée à 40% au démarrage de l’usine. Les cellules composant ces pics de TCC sont donc principalement des LNA. Il s’agit de cellules qui se développent sur les filtres, passent dans la phase liquide durant la période de stagnation et sont éliminées lors de la mise en route du traitement [21]. Ces cellules, peu actives, ne bénéficient pas de conditions favorables à leur multiplication durant la période de stagnation, suggérant que le COA de l’eau est consommé entre deux cycles de traitement.

CONCLUSION

L’analyse par cytométrie en flux apporte des informations importantes relatives à la qualité microbiologique de l’eau distribuée. Elle permet de déterminer rapidement le nombre de cellules dans un échantillon d’eau, d’en estimer la vitalité par le rapport HNA/TCC et d’évaluer si l’eau analysée fait encourir un risque aux consommateurs. C’est aussi un outil de gestion indispensable pour la surveillance microbiologique:

  • de réseaux étendus de distribution, en particulier dans les secteurs où le renouvellement de l’eau est lent en raison d’une faible consommation;
  • de réseaux alimentés par des ressources en eau traitée de qualité microbiologique variable et
  • de réseaux désinfectés au chlore pour le maintien de la qualité microbiologique de l’eau, dans lesquels un développement bactérien et même de biofilms peut survenir lorsque la teneur en chlore résiduel devient faible.

La cytométrie de flux a donc tous les atouts pour suppléer l’analyse des germes aérobies mésophiles dans le cadre de la surveillance microbiologique d’un réseau [34]. En plus, un contrôle en continu de la qualité microbiologique d’une eau de réseau est possible avec la cytométrie de flux. Le suivi des paramètres microbiologiques, à savoir les cellules totales, intactes et la part respective des HNA et des LNA permet de détecter rapidement des anomalies microbiologiques dans un réseau de distribution, par exemple une infiltration d’eaux usées, une éventuelle instabilité biologique de l’eau ou l’arrivée d’une eau traitée chargée en cellules. La transmission des données au centre de gestion offre la possibilité de faire parvenir une alarme à une personne de piquet en cas de dépassement d’une valeur maximale. L’exploitant a ainsi la possibilité d’intervenir rapidement en cas de problème.
La définition d’un seuil d’alarme n’est certes pas triviale et nécessite une réflexion approfondie pour déterminer à partir de quelle amplitude de variation du signal au temps t la valeur mesurée peut être considérée comme anormale et donc déclencher une action. Le seuil d’alarme peut correspondre à une valeur maximale qui est déterminée après un suivi analytique de plusieurs mois. Ce seuil peut aussi être une variation de la valeur au temps t de plus de 3 déviations standard (Xmoyen ± 3σ) par rapport à la moyenne des valeurs mesurées en continu sur une période d’un ou plusieurs jours [35]. Enfin, le suivi des cellules en continu constituera un complément à l’analyse combinée et en continu de plusieurs paramètres physico-chimiques.
Finalement, la cytométrie de flux et, en particulier, la cytométrie de flux en continu permettent d’améliorer considérablement la surveillance d’un réseau d’eau et, par-là, la sécurité de l’alimentation en eau des consommateurs.

 

Méthodes: Analyse microbiologique, cytométrie de flux et chloration 
Germes aérobies mesophiles

L’analyse des germes aérobies mésophiles (GAM) a été effectuée par l’ensemencement d’un échantillon d’eau dans la gélose «Plate Count Agar» (PCA) selon les directives de la norme ISO 4833. Le nombre de colonies par ml d’échantillon (Unités Formatrices de Colonies ou UFC) est obtenu après avoir placé la gélose pendant trois jours à 30 °C.

Coliformes

La recherche des coliformes a été réalisée par filtration d’un échantillon d’eau de 100 ml sur une membrane selon l’ancienne méthode du Manuel suisse des denrées alimentaires (MSDA). Le résultat est donné en UFC par 100 ml après 2 jours à 37 °C.

Cytométrie de flux

L’analyse des cellules par cytométrie de flux a été effectuée avec un appareil Accuri C6 selon les indications de la méthode 333.1 du MSDA [36]. Le suivi analytique a été réalisé de janvier 2016 à septembre 2017 par le prélèvement d’échantillons hebdomadaires ou bimensuels à la sortie de l’usine des Moyats, à l’arrivée de l’eau traitée au réservoir des Foulets et aux extrémités des zones de pression ville, Pouillerel et Mt Cornu (voir fig. 1). Les analyses des TCC et des HNA en continu ont été réalisées avec l’appareil BactoSense développé par l’entreprise bNovate.

Chloration

La chloration de l’eau a été effectuée avec du chlore électrolytique. Traitement par chloration de l’eau brute à l’usine des Moyats; chloration secondaire pour la protection du réseau à l’entrée des réservoirs du Vuillème et des Foulets (réseau de distribution), dans la conduite alimentant le réservoir de Pouillerel (ZP Pouillerel) et à la sortie du réservoir du Mt Cornu (ZP Mt Cornu). Teneur moyenne en chlore libre dans le réseau: 0,02 à 0,03 mg/l.

 

Rénovation de la station de traitement d’eau du lac de Champ-Bougin

La station de traitement de Champ-Bougin, qui alimente en eau d’appoint la ville de Neuchâtel et également le réseau du SIVAMO, est actuellement en cours de rénovation et d’assainissement. La nouvelle chaîne de traitement comprendra les étapes suivantes: préfiltration rapide sur filtre monocouche, ultrafil­tration, ozonation, filtration rapide sur charbon actif en grain, et une désinfection finale.

 

Graphique en boîte à moustaches

Le graphique en boîte à moustaches est une invention du statisticien J. W. Tukey pour représenter schématiquement la distribution d’une variable. La boîte, qui est délimitée par les quartiles inférieur (quartile Q1) et supérieur (quartile Q3), soit les centiles 25 et 75%, comprend le 50% des valeurs situées dans la partie centrale d’une distribution. La médiane (quartile 2, centile 50%) et la valeur moyenne des mesures sont représentées par une ligne horizontale, respectivement par le signe X dans la boîte. Les moustaches marquent les valeurs minimales et maximales de la distribution, mais elles correspondent au maximum à 1,5 * l’écart interquartile (Q3-Q1*1,5) à partir du seuil des quartiles inférieur et supérieur. Les valeurs situées au-delà des moustaches (cercles) sont aberrantes. La zone délimitée par la boîte et les moustaches devrait contenir 99,3% des valeurs d’une distribution normale [37].

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Remerciements

Les auteurs remercient vivement l’entre­prise bNovate, à 1024 Ecublens, pour la mise à disposition de l’appareil BactoSense et M. Jérémy Senouillet (bNovate) pour son soutien technique.

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