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Fachartikel
30. Juni 2022

Molekularbiologische Monitoringmethoden

DNA-Metabarcoding des Zooplanktons

Dem Monitoring kommt eine grosse Bedeutung in der Erkennung von Veränderungen zu und liefert die Grundlage für ein effektives Management seitens der Wasserwirtschaft. Das Institut für Seenforschung (ISF) der Landesanstalt für Umwelt Baden-Württemberg (LUBW) koordiniert das Monitoring der Gewässerqualität des Bodensees im Rahmen der Internationalen Gewässerschutzkommission für den Bodensee (IGKB). Ziel der vorliegenden Studie war es, ein Metabarcoding-Protokoll zum Monitoring des Zooplanktons des Bodensees zu entwickeln, um das gemeinsame Monitoring der Bodenseeanrainerstaaten durch moderne molekularbiologische Methoden zu ergänzen.
Iris Dröscher, Thorsten Rennebarth, Bernd Wahl Bernd Wahl, Frauke Lüddeke, Petra Teiber-Siessegger , 

Aktuell wird der potenzielle Einsatz molekularbiologischer Verfahren im biologischen Monitoring und in der Bewertung von Oberflächengewässern nach EG-Wasserrahmenrichtlinie untersucht und diskutiert [z. B. 1–3]. Beim Metabarcoding wird DNA aus Proben extrahiert, um bestimmte Genabschnitte (d. h. Marker) mithilfe möglichst universeller Primer zu amplifizieren und über das Next-Generation-Sequencing (NGS)-Verfahren zu sequenzieren. Gut geeignete Marker sind in möglichst allen Taxa einer bestimmten taxonomischen Gruppe vorhanden, weisen andererseits aber auch ausreichend artspezifische Bereiche auf, um zwischen Taxa differenzieren zu können. Herkömmliche, auf Sanger-Sequenzierung basierende DNA-Barcoding-Protokolle sind sehr kosten- und arbeitsaufwändig, da jeweils nur ein DNA-Fragment sequenziert wird. Das NGS-Verfahren hingegen ermöglicht die simultane Sequenzierung tausender DNA-Fragmente. Im Allgemeinen lassen sich zwei Metabarcoding-Verfahren unterscheiden. Das eDNA-Metabarcoding zielt dabei auf Umwelt-DNA (d. h. eDNA) ab, also auf genetisches Material, das von Organismen an die Umwelt abgegeben wird (z. B. Faeces, abgestossene Zellen). Während Umweltproben nur sehr wenig relevante DNA enthalten und diese zudem meist degradiert ist, enthalten Organismenproben DNA von relativ hoher Qualität. Diese Form des Metabarcodings (Bulk-Metabarcoding) eignet sich daher insbesondere, wenn Organismenproben, wie im Falle des Zooplanktons, relativ einfach zu erhalten sind [4]. Zur Evaluation des Bulk-Metabarcoding-Verfahrens hinsichtlich der qualitativen und quantitativen Aussagekraft wurden einerseits (1) die durch das Metabarcoding gewonnenen Artenlisten mit den auf morphologischen Kriterien basierenden Artenlisten und andererseits (2) die taxonspezifischen Sequenzhäufigkeiten mit den artspezifischen Biovolumina (als Proxy der Biomasse) verglichen. Die Ergebnisse werden für die taxonomischen Gruppen der Cladocera, Copepoda sowie Rotifera separat diskutiert.

Vorgehensweise

Zwischen November 2019 und November 2020 wurden monatlich an fünf bis sechs ausgewählten Probenahmestellen im Bodensee-Obersee zeitlich simultan jeweils zwei Zooplanktonproben mit zwei Schliessnetzen mit Aufsatzkegel und einer Maschenweite von 55 µm genommen. Die Proben wurden für die lichtmikroskopische Auswertung in Zuckerformol bzw. für das Bulk-Metabarcoding in 96%igem Ethanol fixiert. Bei der lichtmikroskopischen Auswertung des Zooplanktons wurde das taxonspezifische Biovolumen [cm³/l] ermittelt. Für das Bulk-Metabarcoding wurde die DNA aus den Proben extrahiert und die genetischen Marker durch eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) vervielfältigt. Zur Charakterisierung der Zooplankton-Artengemeinschaft wurden sowohl die mitochondriale Cytochrom c Oxidase Subunit 1 (COI) als auch die ribosomale Internal Transcribed Spacer-Region (ITS1) als Markergen verwendet. Um möglichst viele Taxa zu amplifizieren, wurden degenerierte Primer, d. h. ein Gemisch aus ähnlichen Primer-Sequenzen, verwendet. Als Grundlage wurden die Primerpaare mlCOIintF und jgHCO2198 bzw. ITS2 und ITS5 verwendet. Die amplifizierten DNA-Fragmente wurden durch die Firma Eurofins mittels Next Generation-Sequenzierung von Amplikons mittels Illumina MiSeq-Technologie sequenziert. Die DNA-Sequenzen wurden anschliessend mit den in der frei zugänglichen Referenzdatenbank GenBank des National Center for Biotechnology Information (NCBI) hinterlegten Sequenzen abgeglichen. Neben frei zugänglichen Referenzsequenzen wurden ausserdem eigene Referenzsequenzen verwendet, die durch Sanger-Sequenzierung einiger anhand morphologischer Merkmale identifizierter Individuen (Daphnia hyalina, D. x obscura, D. galeata, Bosmina longicornis, Eudiaptomus gracilis und Mesocyclops leukartii) ermittelt wurden.

Ergebnisse
Gruppe Cladocera

Mit Ausnahme von Daphnia x krausi konnten alle zwölf mikroskopisch bestimmten Cladocerenarten auch molekularbiologisch nachgewiesen werden (Tab. 1, Fig. 1a-d). Für Daphnia x krausi, eine relativ seltene Art, fehlen Referenzsequenzen. Setzt man eine Übereinstimmung von mindestens 98% mit der Referenzsequenz voraus, wird Diaphanosoma brachyurum, eine relativ häufige Cladocere, nicht klassifiziert. Dies ändert sich, wenn man eine Übereinstimmung von nur 95% voraussetzt. Unter dieser Voraussetzung wurden ausserdem auch einige wenige Sequenzen als Diaphanosoma orghidani klassifiziert. Diaphanosoma orghidani ist in Osteuropa, Zentral- und Kleinasien, Irak und im östlichen Nordafrika verbreitet. Es handelt sich daher wahrscheinlich um eine Fehlklassifikation. Es sind aber auch Funde dieser pelagisch lebenden Art aus Hafenbecken und einem Altarm des Rheins in der Nähe von Bonn bekannt [5]. Mit dem COI-Marker konnte eine doppelte Anzahl von Arten ermittelt werden als mit dem ITS-Marker. Dennoch wurde Bosmina longispina nur durch das ITS-Metabarcoding erfasst. Im Allgemeinen wurden die einzelnen Arten über das Metabarcoding in mehr Proben nachgewiesen als über die mikroskopische Auswertung alleine. Ausgenommen davon sind die problematischen Arten Daphnia x krausi und Diaphanosoma brachyurum. Darüber hinaus wurde für einige der Cladoceren-Taxa (d. h. für Daphnia hyalina, Bythotrephes longimanus, Diaphanosoma brachyurum, Leptodora kindtii, Bosmina coregoni/Bosmina longicornis, Daphnia cucullata) eine mittlere bis sehr hohe Korrelation zwischen der Anzahl der Reads und dem taxonspezifischen Biovolumen ermittelt.

Gruppe Copepoda

Mit Ausnahme von Eudiaptomus graciloides konnten alle zehn mikroskopisch bestimmten Copepodenarten auch molekularbiologisch nachgewiesen werden (Tab. 2, Fig. 2). Eudiaptomus graciloides wurde jedoch nur in einer einzigen Zählprobe gefunden, und dies könnte erklären, warum diese seltene Art nicht auch genetisch nachgewiesen wurde. Allerdings wurden über das molekularbiologische Verfahren sechs bzw. neun zusätzliche Arten (bei einer Übereinstimmung mit der Referenzsequenz von mind. 98% bzw. 95%) erfasst. Dabei handelt es sich um Acanthocyclops robustus, A. vernalis, A. americanus, Cyclops kikuchii, Cyclops ochridanus, Diaptomus castor, Eudiaptomus macruroides, Hesperodiaptomus arcticus und Megacyclops viridis. Das Vorkommen von Acanthocyclops robustus im Bodensee ist aus dem Langzeitmonitoring bekannt, das von A. vernalis und A. americanus hingegen nicht. Es handelt sich um kryptische Arten des Acanthocyclops vernalis-Artenkomplexes, die anhand klassischer morphologischer Merkmale kaum unterscheidbar sind [6]. Eine Fehlklassifikation ist unwahrscheinlich, da die Arten auch bei Erhöhung des Schwellenwerts für die Sequenzähnlichkeit auf 100% klassifiziert wurden. Dasselbe gilt für Cyclops kikuchii. Vormals als Unterart von der im Bodensee vorkommenden Cyclops vicinus geführt, ist Cyclops kikuchii unter anderem aus einem künstlichen Weiher (Neuweiher) in der Nähe von Meersburg bekannt [7]. Das Vorkommen von Megacyclops viridis im Bodensee ist aus dem Langzeitmonitoring bekannt. Cyclops ochridanus, eine genetisch eng mit C. divergens verwandte Art, ist hingegen ein Endemit aus dem Ohridsee [8]. Diaptomus castor ist unter anderem aus dem Litzelsee bei Radolfzell/Markelfingen bekannt und bewohnt nahezu ausschliesslich kleinere Wasseransammlungen, die in der Regel nicht ausdauernd sind [9]. Auch die mitteleuropäische Art Eudiaptomus macruroides tritt bevorzugt in perennierenden Kleingewässern, in Teichen aber auch im Litoral grösserer Seen auf [10]. Hesperodiaptomus arcticus bewohnt alpine Seen Nordamerikas [11]. Es handelt sich bei diesen Taxa daher mit grosser Wahrscheinlichkeit um Fehlklassifikationen. Im Gegensatz zu den Cladoceren konnte hier mit dem ITS-Marker eine höhere Anzahl von Arten erfasst werden als mit dem COI-Marker. Dennoch wurden Acanthocyclops robustus und Eudiaptomus gracilis nur durch das COI-, aber nicht durch das ITS-Metabarcoding erfasst. Auch bei den Copepoden wurden die einzelnen Arten über das Metabarcoding im Allgemeinen in mehr Proben nachgewiesen als über die mikroskopische Auswertung allein. Nur für wenige der Copepoden konnte eine mittlere bis hohe Korrelation (Mesocyclops leuckarti, Cyclops abyssorum, Thermocyclops oithonoides) zwischen der Anzahl der Reads und dem taxonspezifischen Biovolumen ermittelt werden.

Gruppe Rotifera

Bezüglich der Rotiferen konnten von 26 lichtmikroskopisch bestimmten Arten nur sieben Taxa auch molekularbiologisch nachgewiesen werden (Tab. 3, Fig. 3a und b). Mittels Metabarcoding wurden jedoch acht zusätzliche Arten (Ascomorpha ecaudis, Brachionus calyciflorus, Brachionus quadridentatus, Colurella dilitata, Euchlanis dilitata, Keratella valga, Lecane bulla und Lepadella rhombiodes) erfasst, die lichtmikroskopisch nicht bestimmt wurden. Bei Keratella valga, eine Art, die aus Gewässern mit acidem Charakter bekannt ist [12], handelt es sich mit einer hohen Wahrscheinlichkeit um eine Fehlklassifikation. Die übrigen Arten sind jedoch aus dem Bodensee bekannt. Da sie nur in einer Minderzahl der untersuchten Proben detektiert wurden, handelt es sich um relativ seltene Arten, die wahrscheinlich aus diesem Grund nicht lichtmikroskopisch nachgewiesen wurden. Die 19 Arten, die nur lichtmikroskopisch, aber nicht genetisch erfasst wurden, sind hingegen mit wenigen Ausnahmen durchaus häufige bis sehr häufige Arten. Rotiferen zeichnen sich durch eine hohe genetische Vielfalt aus und sind aufgrund der Ineffizienz universeller Primer nur schwer zu sequenzieren [13]. Die Arten, die sowohl lichtmikroskopisch als auch über das Metabarcoding erfasst wurden, wurden durch das molekularbiologische Verfahren, mit Ausnahme von Polyartha vulgaris, allerdings gut repräsentiert. Das heisst, es bestanden keine beträchtlichen Differenzen hinsichtlich der Anzahl der Proben mit nachgewiesen Funden für die beiden Verfahren. Für diese Arten bestand ausserdem eine mittlere bis sehr hohe Korrelation zwischen dem Biovolumen und der Anzahl der klassifizierten Sequenzen.

Diskussion

Im Allgemeinen wurde über das Metabarcoding die Artengemeinschaft an den einzelnen Probestellen vollständiger erfasst als über die lichtmikroskopische Auswertung. Nachdem Zooplanktonproben standardmässig nicht komplett ausgezählt werden, ist es vorstellbar, dass insbesondere Arten geringer Populationsdichte in den lichtmikroskopischen Teilproben unter Umständen nicht erfasst wurden. Auch war die Differenz der Anzahl der Proben mit nachgewiesen Funden für die beiden Verfahren bei den Copepoden stärker ausgeprägt als bei den Cladoceren. Das lässt sich einerseits darauf zurückführen, dass Nauplien (d. h. die Entwicklungsstadien der Copepoden) zwar lichtmikroskopisch nicht näher bestimmt werden können, aber über das Metabarcoding sehr wohl ihrer taxonomischen Einheit zugeordnet werden können. Andererseits legen Copepoden im Vergleich zu Cladoceren ein grösseres Fluchtverhalten zu Tage [14]. Wird bei der Flucht DNA an die Umwelt abgegeben (z. B. in Form von abgeworfenen Gelegen [15]) und diese in der Probe miterfasst, dann ist denkbar, dass diese Arten mit einer höheren Wahrscheinlichkeit über das molekularbiologische als das lichtmikroskopische Verfahren erfasst werden. Die Artidentifikation hängt unter anderem aber auch von der Wahl des Markergens ab. Durch die parallele Verwendung zweier Markergene konnte ihre Eignung direkt miteinander verglichen werden. Während über das COI-Metabarcoding mehr Cladoceren erfasste wurden als über das ITS-Metabarcoding, funktionierte das ITS-Metabarcoding mit den Copepoden im Allgemeinen besser als das COI-Metabarcoding. Dennoch bestanden taxonspezifische Unterschiede hinsichtlich der Effizienz der beiden Marker. Das Ergebnis verdeutlicht, dass sich die Artidentifikation durch die Kombination evolutionär unabhängiger Marker erhöhen kann. Auch durch eine weniger strenge Festlegung des Cut-Off-Wertes der Sequenzähnlichkeit konnte die Artengemeinschaft vollständiger erfasst werden bzw. ein robusteres Ergebnis hinsichtlich der Anzahl der klassifizierten Sequenzen erzielt werden (Daphina cucullata, Diaphanosoma brachyurum, Acanthocyclops vernalis, Cyclops abyssorum und Keratella quadrata). Aufgrund der unterschiedlichen Eignung von Primern für verschiedene taxonomische Gruppen kann auch die Wahl der Primer die Anzahl der genetisch nachweisbaren Arten in Bulkproben beeinflussen. So scheinen die in dieser Studie gewählten Primer für einen Grossteil der Rotiferen nur bedingt geeignet zu sein. Aufgrund der jüngsten Entwicklung neuer Primerpaare speziell für die Amplifizierung des Markergens COI in Rotiferen [13] kann in Zukunft die Diversität dieser taxonomischen Gruppe mittels molekularbiologischer Verfahren möglicherweise noch besser abgebildet werden. Dies ist von erheblichem Interesse, insbesondere angesichts der hohen Plastizität der morphologischen Merkmale der Rotiferen [16].

Schlussfolgerung

Die Projektergebnisse heben hervor, dass lichtmikroskopische und molekularbiologische Methoden sich sinnvoll ergänzen können. Lichtmikroskopische Methoden liefern im Gegensatz zum Metabarcoding-Verfahren Informationen zur relativen Häufigkeit der einzelnen Arten sowie zur Alters-, Grössen- oder Geschlechtsstruktur der Zooplankton-Population. Andererseits können kryptische Arten (z. B. Artenkomplexe) und Larvenstadien (z. B. Nauplii der Copepoden) über das Metabarcoding unterschieden werden. Auch ist es möglich, seltene bzw. schwer fassbare Arten, die mit herkömmlichen mikroskopischen Verfahren übersehen werden können, genetisch zu erfassen. Dennoch müssen die Ergebnisse des Metabarcodings auch kritisch betrachtet werden, um potenzielle Fehlklassifikationen als solche zu erkennen. Auch können falsch-negativ Ergebnisse in Abhängigkeit von den gewählten Markergenen, den verwendeten Primern und der (Un-)Vollständigkeit der Referenzdatenbank nicht ausgeschlossen werden. Das entwickelte Metabarcoding-Protokoll bietet sich insbesondere zur raschen Erfassung der Artenzusammensetzung der Copepdoden und Cladoceren an.

Bibliographie
[1] Greyer, M. et al. (2018): Integrative Taxonomie mit DNA-Barcoding – Einsatzmöglichkeiten molekularbiologischer Verfahren zur Ermittlung des ökologischen Zustandes nach EG-Wasserrahmenrichtlinie: Erste Erfahrungen aus der Praxis. Sächsisches Landesamt für Umwelt, Landwirtschaft und Geologie. p. 24
[2] Pawlowski, J. et al. (2020): Anwendung von eDNA-Methoden in biologischen Untersuchungen und bei der biologischen Bewertung von aquatischen Ökosystemen. Bundesamt für Umwelt: Bern. p. 77
[3] Schenekar, T.; Schletterer, M.; Weiss, S. (2020): eDNA als neues Werkzeug für das Gewässermonitoring – Potenzial und Rahmenbedingungen anhand ausgewählter Anwendungsbeispiele aus Österreich. Österreichische Wasser- und Abfallwirtschaft 72: 155–164
[4] van der Loos, L.M.; Nijland, R. (2021): Biases in bulk: DNA metabarcoding of marine communities and the methodology involved. Molecular Ecololgy 30: 3270–3288
[5] Weiler, W. (1997): Erstfund von Diaphanosoma orghidani Negrea 1982 (Crustacea: Sididae) für Deutschland und ihre Begleitarten. Lauterbornia 32: 73–77
[6] Dodson, S.I.; Grishanin, A.; Gross, K.; Wyngaard, G. (2003): Morphological analysis of some cryptic species in the Acanthocyclops vernalis species complex from North America. Hydrobiologia 500: 131–141
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[15] Svensson, J.E. (1996): Clutch detachment in a copepod after capture by a predator. Journal of Plankton Research 18: 1369–1374
[16] Gilbert, J.J. (2017): Non-genetic polymorphisms in rotifers: Environmental and endogenous controls, development, and features for predictable or unpredictable environments. Biological Reviews 92: 964–992
Danksagung

Diese Studie erhielt Unterstützung durch das Forschungsprojekt «SeeWandel: Leben im Bodensee – gestern, heute und morgen» im Rahmen des Interreg V-Programms «Alpenrhein-Bodensee-Hochrhein (Deutschland/Österreich/Schweiz/Liechtenstein)», welches Mittel aus dem Europäischen Fonds für regionale Entwicklung sowie Fördergelder vom Schweizer Bund und den Kantonen erhält. Es bestand keine aktive Mitwirkung seitens der Geldgeber bei der Entwicklung des Studiendesigns, der Datenerfassung und -analyse, der Entscheidung zur Veröffentlichung oder bei der Erstellung des Manuskriptes.

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