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Fachartikel
26. November 2021

Molekularbiologische Methoden

Charakterisierung von Legionellen

In der Praxis werden Legionellen primär mittels kultivierungsbasierter Methoden im Wasser nachgewiesen und quantifiziert. Nun rücken neue Entwicklungen vermehrt auch molekularbiologische Methoden in den Fokus, die bisher vor allem im Forschungskontext eingesetzt wurden. Sie bergen das Potenzial, einige Aspekte der Kultivierungsmethoden zu ergänzen, vervollständigen oder allenfalls sogar zu ersetzen. Zudem ermöglichen molekularbiologische Methoden die Ökologie von Legionellen in Trinkwassersystemen besser zu verstehen.
Alessio Cavallaro, William J. Rhoads, Franziska Rölli, Hans Peter  Füchslin, Daniel  Mäusezahl, Timothy R.  Julian, Lea Caduff, Thierry Marti, Frederik Hammes, 

Die im Wasser lebenden Legionellen-Bakterien können beim Menschen u. a. schwere Lungenentzündungen auslösen, wenn sie über feine Wassertröpfchen (Aerosole) eingeatmet werden. Deswegen müssen sie zumindest in gewissen Wassersystemen wie öffentlich zugänglichen Bädern und Duschanlagen überwacht werden [1]. Dazu griff man bisher auf kultivierungsbasierte Methoden zurück, die allerdings mit einigen Nachteilen behaftet sind: Im Allgemeinen sind sie langsam, arbeitsintensiv und geben zudem keinen Einblick in die Wechselwirkungen zwischen Legionellen und anderen Mikroorganismen. Da Legionellen natürlicherweise im Wasser vorkommen (Fig. 1), ist es wichtig, solche Wechselwirkungen zu verstehen. Verschiedene molekularbiologische Methoden bieten die Möglichkeit, einige Einschränkungen von Kultivierungsmethoden zu überwinden und das Verständnis darüber, wie sich Legionellen in Wassersystemen vermehren, zu verbessern.

Seit Anfang 2020 finanzieren das Bundesamt für Lebensmittelsicherheit und Veterinärwesen (BLV), das Bundesamt für Gesundheit (BAG) und das Bundesamt für Energie (BFE) gemeinsam das LeCo-Projekt zur Legionellenbekämpfung in Gebäuden. Eine Aufgabe des Projekts ist es, herauszufinden, wie molekularbiologische Werkzeuge zur Charakterisierung von Legionellen eingesetzt werden können. Nachfolgend wird ein Überblick über solche Methoden gegeben und ihre Funktionsweise erläutert. Weiter wird aufgezeigt, welche Fragen mittels welcher Methoden beantwortet werden können und wie diese im LeCo-Projekt eingesetzt werden.

Molekularbiologische Methoden

Molekularbiologische Methoden nutzen die Erbinformation von Mikroorganismen und charakterisieren diese auf der Grundlage der in ihren Genen enthaltenen Informationen. Einige Gene werden von vielen Mikroorganismen genutzt, andere sind für eine bestimmte Art, Stamm, Funktion oder Eigenschaft einzigartig. Die Suche nach Genen, die mit bestimmten Mikroorganismen assoziiert sind, ermöglicht den Nachweis, die Identifizierung und die Quantifizierung spezifischer Mikroorganismen (z. B. des Krankheitserregers Legionella pneumophila). Die Suche nach Genen, die von vielen Mikroorganismen genutzt werden, ermöglicht dagegen eine Charakterisierung einer grösseren Gruppe verschiedener Mikroorganismen in einer Probe.

Vorteile

Molekularbiologische Methoden bieten folgende Möglichkeiten:

  • Nachweis, Identifikation und Quantifizierung von Mikroorganismen in der Wasserprobe, die sich nicht ohne Weiteres anhand von Kulturen im Labor züchten lassen.
  • Nachweis von Mikroorganismen, die sich grundsätzlich im Labor züchten lassen, aber aufgrund ihres physiologischen Zustandes nicht jederzeit kultivierbar sind (manchmal auch als «lebensfähig, aber nicht kultivierbar» oder VBNC bezeichnet).
  • Spezifischere Informationen zu Mikroben von Interesse als die Kultivierung, z. B. durch die Identifizierung von Spezies- oder Subspezies-Stämmen von Krankheitserregern.
  • In der Regel schnellere Ergebnisse als die Kultivierung, höherer Durchsatz und Möglichkeit der Automatisierung der nötigen (Teil-)Schritte.

Nachteile

Der Hauptnachteil molekularbiologischer Methoden liegt in den eingeschränkten Möglichkeiten, DNA aus lebenden und toten Zellen zu unterscheiden. Dies erschwert die Einschätzung eines potenziellen Infektionsrisikos. Eine Lebend-/Tot-Differenzierung erfordert in der Regel umfangreiche Vorbehandlungen, die nicht weit verbreitet sind, spezielles Equipment und Expertise erfordern und in Ergebnissen resultieren, die dennoch eher schwierig zu interpretieren sind.

Im Legionellenkontext

Der Einsatz von molekularbiologischen Methoden im Zusammenhang mit Legionellen birgt das Potenzial, einige Aspekte der Kultivierungsmethoden ergänzen, vervollständigen oder allenfalls sogar ersetzen zu können (Fig. 2). Dazu bauen die meisten molekularen Methoden auf der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) auf. Anhand dieser werden Millionen bis Billionen von Kopien eines bestimmten DNA-Fragments erzeugt. Das DNA-Fragment kann so gewählt werden, dass entweder die Summe verschiedener Organismen (z. B. alle Bakterien oder Protozoen), mehrere Arten einer Gattung (z. B. Legionella spp.) oder nur eine einzelne Art oder Unterart (z. B. L. pneumophila oder L. pneumophila Serogruppe 1) nachgewiesen und quantifiziert wird. Molekulare Methoden, die auf Isolate angewandt werden, die nur einen spezifischen Legionellenstamm enthalten, können zur Identifizierung der Art, der Serogruppe oder des Sequenztyps der kultivierten Legionellen verwendet werden. Unter anderem, um schnell zu bestätigen, ob es sich bei den auf den Kulturplatten wachsenden Bakterien um Legionellen handelt, und um diese allenfalls weiter zu charakterisieren (Fig. 2, A). Aber auch um beispielsweise festzustellen, welche Funktionen dieser Stamm hat (z. B. Nachweis von wichtigen Pathogenitätsfaktoren; Fig. 2, D).

Im Zusammenhang mit Umweltproben, die in der Regel gemischte mikrobielle Gemeinschaften enthalten, können molekulare Methoden genutzt werden, um diese vor einer allfälligen Kultivierung einem raschen Screening zu unterziehen und Proben mit Legionellen von solchen ohne Legionellen zu separieren (Fig. 2, B). Weiter können sie eingesetzt werden, um die Konzentration der Legionellen zu bestimmen (Fig. 2, C) und/oder die Probe auf weitere Organismen (Fig. 2, E) sowie ihre Funktionen innerhalb der Gemeinschaft zu untersuchen (Fig. 2, F).

PCR-basierte Techniken

PCR-Techniken beruhen auf der Vervielfältigung eines bestimmten Abschnitts der DNA. Sie können u. a. genutzt werden, um verdächtige Legionellen-Kolonien zu bestätigen (Fig. 2, A), eine Probe auf die Anwesenheit von Legionellen zu überprüfen (Fig. 2, B) und um Legionellen in einer Probe zu quantifizieren (Fig. 2, C).

Bestätigung verdächtiger Legionellen-Kolonien (A)

Die ISO 11731 ist die international anerkannte Kultivierungsmethode für den Nachweis von Legionellen [2]. Sie wird unter anderem eingesetzt, um die Einhaltung des Höchstwertes von 1000 KBE pro Liter für Legionella spp. im Bad- und Duschwasser in öffentlich zugänglichen Bädern und Duschanlagen zu kontrollieren [1]. Allerdings ist die Methode nach ISO 11731 zeitaufwendig. Nach der Aufbereitung und Inkubation der Proben auf GVPC (Glycine Vancomycin Polymyxin Cycloheximide)-Selektivagarplatten für maximal zehn Tage werden verdächtige Legionellen-Kolonien (aufgrund der Morphologie) erneut auf Selektivplatten mit und ohne L-Cystein (einem essenziellen Legionellen-Wachstumsnährstoff) ausplattiert und für weitere zwei bis fünf Tage inkubiert (Fig. 2, oben). Bei einem «positiven» Wachstumsmuster auf Agarplatten mit L-Cystein und «negativem» auf Agarplatten ohne L-Cystein ist die übertragene Kolonie gemäss ISO 11731 als Legionella spp. bestimmt. Eine zusätzliche Bestätigung von Legionella spp. und die Identifizierung der Spezies und Serogruppe kann mit handelsüblichen Latex-Agglutinationskits erfolgen [3].

Die Industriellen Werke Basel (IWB) und das Kantonale Labor Zürich (KLZH) haben eine PCR-basierte Methode für die Bestimmung von verdächtigen Kolonien direkt ab der ersten ISO-11731-Kultivierungsagarplatte entwickelt und in die Routine übernommen [4]. Durch Vermeidung des zweiten Kultivierungsschritts und anschliessender Agglutinationstests kann der Zeitbedarf bis zum Erhalt des Ergebnisses um zwei bis fünf Tage verkürzt werden. Zwecks Evaluierung dieser neuen Vorgehensweise wurden 290 Parallelmessungen nach ISO 16140 [5] ausgewertet. Kolonien von Proben mit unterschiedlichen Resultaten nach Anwendung der Standardmethode und der neuen PCR-Methode wurden zur weiteren Abklärung ins nationale Referenzzentrum für Legionellen (NRZL) in Bellinzona geschickt, welches durch das BAG finanziert ist.

Es zeigte sich, dass das PCR-Verfahren eine höhere Spezifität aufweist. Anhand einer Multiplex-PCR (mehrere unterschiedliche PCR in einer Reaktion zusammengefasst) kann aktuell zudem eine verdächtige Kolonie auf Legionellen untersucht und gleichzeitig als Legionella spp., L. pneumophila oder L. pneumophila Serogruppe 1 identifiziert werden. Es ist denkbar, diese Identifikation zukünftig auf weitere klinisch relevante Legionellen-Stämme auszuweiten.

Quantitative PCR für Nachweis und Auszählung von Legionellen (B), (C)

Bei der quantitativen PCR wird die Anzahl der Kopien eines Gens in einer Probe quantifiziert, indem ein Fluoreszenzsignal an jede neue Kopie der während der PCR erzeugten Ziel-DNA angehängt und gemessen wird. Auf diese Weise kann abgeschätzt werden, wie viele Legionellenzellen in der Probe vorhanden waren. Die internationale Norm ISO/TS 12869:2019 legt die allgemeinen Anforderungen für die Entwicklung und Validierung quantitativer PCR-Assays für Legionellen fest [6]. Dies sowohl für Assays, mittels derer alle Legionellen der Gattung (Legionella spp.) quantifiziert werden können, wie auch für solche, mittels derer spezifische Arten oder Unterarten von Legionellen (z. B. L. pneumophila oder L. pneumophila Serogruppe 1) quantifiziert werden.

Der Einsatz der quantitativen PCR erlaubt es, gezielt solche pathogenen Legionellen-Stämme zu quantifizieren und so spezifischer das Gesundheitsrisiko einzuschätzen (Fig. 2, C). Die Anzahl der auf diese Art und Weise nachgewiesenen Genkopien steht allerdings in einem uneinheitlichen Verhältnis zu den durch Ausplattieren erhaltenen koloniebildenden Einheiten. Es wird deshalb aktiv an der Entwicklung von Tests geforscht, die nur auf DNA in lebenden Zellen abzielen (d. h. «Lebensfähigkeitstests»). Diese werden zurzeit noch nicht standardmässig eingesetzt und sind teilweise auch in ihrer Aussagekraft noch nicht völlig ausgereift. Die quantitative PCR erfordert zudem jeweils eine laborspezifische Etablierung und Instrumentenoptimierung. Zudem gibt es keine standardisierten Parameter für die Qualitätssicherung/-kontrolle, die den Vergleich der Ergebnisse aus Umweltproben von einem Labor zum anderen erleichtern würden.

Es ist denkbar, dass die quantitative PCR zukünftig auch zum Beispiel zwecks Screenings eines grösseren Probensets eingesetzt wird, um diejenigen Proben zu identifizieren, die Legionellen-positiv sind (Fig. 2, B). Diese Vorselektion würde es erlauben, den Kultivierungsaufwand zu minimieren. Aber auch für die routinemässige Überwachung der Legionellensituation in risikosensiblen Gebäuden (z. B. Krankenhäuser, Alterszentren etc.) bietet die quantitative PCR Potenzial.

In LeCo wird die quantitative PCR genutzt, um simultan Gene von Legionella spp. und L. pneumophila nachzuweisen und zu quantifizieren. Zudem werden verschiedene Datensets generiert, gesammelt und ausgewertet sowie ein neuartiger Lebensfähigkeitstest evaluiert, um den Zusammenhang zwischen den PCR- und Kultivierungsergebnissen besser zu verstehen. Weiter soll eine Empfehlung erarbeitet werden, wie die PCR im Legionellenkontext zukünftig zielführend eingesetzt werden kann, und welche Aspekte betreffend Qualitätssicherung und Interpretation in diesem Zusammenhang beim Nachweis von Legionellen aus Umweltproben berücksichtigt werden sollten.

Sequenzierungstechniken

Die Grundlage aller Sequenzierungstechniken ist die Bestimmung der DNA-Sequenzen in einer Probe. Diese können zur Charakterisierung von Kulturen eines bestimmten Organismus (Fig. 2, D) oder der gesamten mikrobiellen Gemeinschaft in einer Probe (Fig. 2, E & F) verwendet werden.

Gesamtgenom von Reinkultur-Isolaten (D)

Mithilfe der «Ganzgenomsequenzierung» (WGS; Whole Genome Sequencing) können Spezies und Stamm eines isolierten Bakteriums identifiziert werden. Diese kann aber auch genutzt werden, um spezifische genetische Marker – z. B. Virulenzfaktoren, die auf eine potenzielle Infektiosität hinweisen – nachzuweisen und festzustellen, wie eng ein Isolat mit anderen Legionellen-Bakterien verwandt ist. Sind die Bakterien eng miteinander verwandt, ist dies ein Hinweis, dass sie aus derselben Quelle stammen könnten. Mithilfe der WGS kann also abgeschätzt werden, ob ein Isolat aus einer bestimmten Wasserquelle die Ursache eines festgestellten Krankheitsfalls war, und es können Trends im Auftreten von Krankheiten verfolgt werden [7].

Der Hauptvorteil des WGS ist, dass es sich um ein einziges Verfahren handelt, das alle genetischen Informationen über ein Isolat liefert. Dies im Gegensatz zu herkömmlichen Identifizierungsmethoden, die wesentlich mehr Tests erfordern. Das WGS ist jedoch teuer (Hunderte von Schweizer Franken pro Isolat). Zudem ist erhebliches Fachwissen erforderlich, um die Genomsequenz der Nukleotide in nützliche Informationen umzuwandeln. Da diese Verfahren aber immer kostengünstiger und einfacher in der Handhabung werden, wird sich WGS idealerweise von einem Forschungsinstrument zu einer primären klinischen Überwachungsmethode entwickeln.

Im LeCo-Projekt wird das WGS eingesetzt, um die aus Patienten und Patientinnen isolierten Legionellen-Stämme mit Stämmen zu vergleichen, die aus den Wohnungen der Patienten und Patientinnen isoliert wurden. Dies, um festzustellen, ob es Verbindungen zwischen Legionellen, die schwere Krankheiten verursachen, und Legionellen aus bestimmten Umweltquellen gibt. Die genetischen Marker oder Merkmale könnten zudem das Verständnis dafür verbessern, warum Legionellen häufig in Haushalten vorkommen und dennoch selten zu einer schweren Erkrankung bei den Bewohnern führen.

16S- und 18S-rRNA-Gen-Sequenzierung (E)

16S- und 18S-Ribosomen-Ribonukleinsäure-(rRNA-)Gene sind allen prokaryotischen (z. B. Bakterien) und eukaryotischen (z. B. Protozoen) Organismen gemeinsam. Wenn diese Gene mittels PCR amplifiziert und sequenziert werden, können anhand der Variabilität der Nukleotide die Klasse, Familie und Gattung aller Organismen in der Probe identifiziert und ihr relativer Anteil an anderen identifizierbaren Taxa quantifiziert werden.

Die 16S- und 18S-Analyse ermöglicht es zu untersuchen, welche Arten in verschiedenen Umgebungen mit Legionellen assoziiert sind, was Aufschluss über die Bedingungen gibt, unter denen sich der Erreger vermehren könnte. Wie beim WGS ist die Methode jedoch teuer und erfordert Fachwissen für die Analyse der Sequenzdaten. Ausserdem ist es schwierig, Organismen auf einer spezifischeren Ebene als derjenigen der Gattung zu identifizieren. Das heisst, man kann nur Legionella spp. identifizieren, nicht aber bestimmte Legionellenarten. Weiter gibt es auch einige Einschränkungen bei der Vervielfältigung der DNA, die zu Ungenauigkeiten bei der Erkennung von Genen führen und die Interpretation der Daten erschweren.

In LeCo wird die 16S- und 18S-Am­plikonsequenzierung eingesetzt, um einen Überblick über die Gemeinschaften zu gewinnen, die mit dem Vorhandensein (oder Nichtvorhandensein) von Legionellen in Verbindung stehen. Dies könnte zu einem besseren Verständnis führen, wie Legionellenbekämpfungsstrategien funktionieren, warum sie manchmal versagen und wie sie verbessert werden könnten.

Shotgung-Sequenzierung/Metagenomik (F)

Shotgun-Sequenzierung/Metagenomik ähnelt dem WGS insofern, als alle in einer Probe vorhandenen Gene sequenziert werden. Allerdings wird dies nicht an einem einzelnen Isolat, sondern an einer Umweltprobe durchgeführt. Sie ähnelt entsprechend auch der 16S-rRNA-Sequenzierung, da sie Informationen über alle Mikroorganismen in einer Probe liefert. Im Gegensatz zu dieser wird aber die gesamte DNA in den Proben sequenziert, statt nur eine bestimmte Sequenz des 16S-rRNA-Gens.

Die Shotgun-/Metagenomik-Sequen­zierung kann detaillierte taxonomische Klassifizierungen der in einer Probe vorhandenen Organismen liefern (d. h. Informationen bis hinunter auf die Ebene der Spezies im Vergleich zur Gattung bei der 16S- oder 18S-rRNA-Sequenzierung), wie auch Einblicke in die Funktionen (z. B. Nährstoffverwertungsmechanismen), die mit bestimmten Genen verbunden sind. Wie bei der WGS ist die Shotgun-Sequenzierung von Gesamt-DNA, die aus Umweltproben extrahiert wurde, teuer und erfordert spezielles Fachwissen, so dass sie sich nicht für eine breite Anwendung eignet. Im LeCo-Projekt wird die Shotgun-Sequenzierung zur Ergänzung der 16S- und 18S-Gemeinschaftsanalyse der Biofilme von Duschschläuchen eingesetzt, um die Taxonomie zu klären und die Zusammenhänge zwischen Vorhandensein/Abwesenheit von Legionellen und spezifischen biologischen Funktionen zu untersuchen.

Fazit

Molekulare Methoden bieten verschiedene Möglichkeiten zur Verbesserung der Erkennung, Quantifizierung und Cha­rakterisierung von Legionellen in Trinkwassersystemen. Während einige Anwendungen die Standardkultivierung zukünftig durch ein schnelles Screening von Proben oder die Identifizierung von Isolaten ergänzen könnten, beleuchten andere die Ökologie von Legionellen und könnten zu neuen Ideen und Strategien zur Kontrolle dieses Erregers in technischen Systemen führen.

Bibliographie

[1] EDI: Verordnung vom 16. Dezember 2016 über Trinkwasser sowie Wasser in öffentlich zugänglichen Bädern und Duschanlagen (TBDV; SR 817.022.11) (Stand 1. August 2021)
[2] DIN EN ISO 11731:2019-03, Wasserbeschaffenheit – Zählung von Legionellen (ISO 11731:2017), Beuth Verlag, Berlin-Wien-Zürich
[3] Reyrolle, M. et al. (2004): Rapid identification of Legionella pneumophila serogroups by latex agglutination. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 23, 864–866
[4] Eble, D. et al. (2021): Comparison of the culture method with multiplex PCR for the confirmation of Legionella spp. and Legionella pneumophila. J Appl Microbiol. 00, 1–10. https://doi.org/10.1111/jam.15103
[5] DIN EN ISO 16140-2:2016-11, Mikrobiologie der Lebensmittelkette – Verfahrensvalidierung - Teil 2: Arbeitsvorschrift für die Validierung von alternativen (urheberrechtlich geschützten) Verfahren anhand eines Referenzverfahrens (ISO 16140-2:2016), Beuth Verlag, Berlin-Wien-Zürich
[6] ISO/TS 12869:2019-04, Wasserbeschaffenheit – Nachweis und Quantifizierung von Legionella spp. und/oder Legionella pneumophila durch Konzentration und genische Verstärkung mittels quantitativer Polymerase-Kettenreaktion (qPCR), Beuth Verlag, Berlin-Wien-Zürich
[7] Raphael, B. H. et al. (2016): Genomic Resolution of Outbreak-Associated Legionella pneumophila Serogroup 1 Isolates from New York State. Applied and environmental microbiology, 82(12), 3582–3590. https://doi.org/10.1128/AEM.00362-16

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